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3 개의 곤충 으로부터 각 Met와 CYC의 전체 ORF를 인코딩하는 cDNA 단편 ― a. 이집트 티, c. pipiens 및 t. 카 스타 움은 SRC의 부분 ORF (L689)를 합성 하였다. 베이 트 플라스 미드는 각각의 곤충에 GAL4 DNA 결합 도메인을 벡터 pGBKT7에 도입 하 여 구축 하였다 (클론 테크). GAL4-각 곤충 CYC 및 T를 사용한 융합 플라스 미드 SRC는 pGADT7 벡터 (클론 테크)를 이용 하 여 프레이 플라스 미드로 서 구성 되었다. 또한, a. 이집트 티 FISC의 부분 ORF (V510)가 pGADT7 벡터로 클로닝 되었다. 이러한 먹이 플라스 미드는 각각 성장 완성 및 정량적 β-갈 락 토시 다 제 분석 법을 이용 하 여 2-하이브리드 결합 시험을 목적으로 Y2HGold 및 Y187 효 모 세포 내로 Met 미끼를 함께 형질 전환 시켰다. 성장에 대 한 보완을 위해, 결합은 합성 드롭아웃 (SD)-/-Trp에서 테스트 한 한 천 배지입니다. 형질 전환 된 Y187 세포는 OD600가 0.3 ~ 0.4까지 도달할 때까지 SD-WAN에서 30 ° c에서 배양 하 고, 이어서 배지 부피의 2 배에 부유 하 게 하였다. 세포를 2 시간 동안 더 인큐베이션 한 다음, 배지 중의 100 µ L을 96-웰 플레이트에 분산 시켰다.

JH 또는 JHA의 상응 하는 농도는 성장 배지 내에 첨가 되 고, 세포는 추가로 3 시간 동안 인큐베이션 되었고 효 모 β-갈 락 토시 다 제 분석 키트 (열 과학)를 사용 하 여 β-갈 락 토시 다 제 분석 법을 적용 하였다. 상기 분석 반응 혼합물을 96-웰 플레이트에서 24 ° c에서 16 시간 동안 인큐베이션 한 후 원심 분리 하였다. 상기 상층 액는 OD420 측정을 행 하였다. 두 모기에서 Met 및 CYC 유전자의 전체 ORFs를 인코딩하는 cDNAs, A. 이집트 티 및 Culex pipiens, 그리고 저장 작물 해충 딱정벌레, 트라이 볼리바르 카 스타 움은 각각 효 모 2 하이브리드 미끼와 먹이 플라스 미드를 합성 하 고 도입 하였다. 이 2 개의 하이브리드 효 모 분석에서, 모기 로부터 만난 및 CYC의 결합은 딱정벌레에서가 아니라는 반면에 JHA, 피리 프로 시 펜의 존재 하에서 발생 하였다 (도 8. S1). 대신에, 우리는 딱정벌레 만난과 SRC 사이의 피리 프로 xyfen 매개 결합을 관찰 하였다 (도. S1). Y2HGold-CYC에 대 한 피리 proxyfen-매개 결합을 만난, c.

pipiens met-CYC, 그리고 비틀이 만난-SRC는 효 모 세포에서 명백 하였다 (도. S1) Y187 이스트 세포에서 2 개의 잡종 효 모 β-갈 락 토시 다 제 분석에 의해 성공적으로 시뮬레이션 되었다. S2). C. pipiens의 결합에서 관찰 된 약한 β-갈 락 토시 다 제 활성은-CYC 및 딱정벌레 Met-SRC는 반드시 결합 자체의 약한 친화도를 나타내지 않고, 친화도가 많은 추가적인 임의 요인에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에 재조합 단백질의 폴딩과 같은 시뮬레이션. 따라서, 우리는 모든 후속 실험에 대 한. 먼저, 피리 프로 시 펀-매개 Met-CYC 결합이 2 개의 하이브리드 효 모 분석에서 식물 추출 물에 의해 중단 될 수 있는지 여부를 조사 하였다. 우리는 1651 식물 종 (한국 식물 추출 물 은행, 한국)에서 제조 된 메탄올 추출 물을 테스트 하 여 각 추출 물을 효 모 문화에 직접 추가 했습니다.